分子生物學(xué)

提供分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)服務(wù)：核酸提取、載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)與純化、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除細(xì)胞系和動物、實時熒光定量PCR等服務(wù)

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除細(xì)胞系篩選和建立

康朗生物可以通過自身T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)抵抗外源微生物的入侵和增殖，而低等的原核生物也有自己的應(yīng)對策略完成自我保護。CRISPR/Cas9系統(tǒng)就是其中一項重要的武器，是細(xì)菌為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒攻擊而演化來的一種獲得性免疫防御機制。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA。此tracrRNA/crRNA復(fù)合體作為引導(dǎo)員引導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點切斷雙鏈DNA。進一步通過細(xì)胞內(nèi)同源重組等修復(fù)機制在切割位點缺失或插入不定長度的堿基序列，使得后續(xù)的細(xì)胞產(chǎn)生移碼突變，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性的喪失。

在針對細(xì)胞的基因組編輯過程中，我們通常將tracrRNA和crRNA融合成為1條sgRNA克隆至表達(dá)載體上，同樣可以起到靶向剪切的作用。通過對Cas9核酸酶進行改造，使其可對任何物種的基因組進行高效定向的編輯，可有效避免脫靶效應(yīng)。

服務(wù)內(nèi)容

1. 敲除基因序列分析，并設(shè)計針對該序列的3-5條sgRNA

2. 將sgRNA與表達(dá)載體連接，篩選陽性sgRNA克?。?/span>

3. sgRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，流式分選GFP陽性細(xì)胞，篩選高效sgRNA；

4. 將sgRNA和Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并篩選鑒定基因敲除細(xì)胞系敲除細(xì)胞株；

5. 基因敲除細(xì)胞株擴大培養(yǎng)，并通過熒光定量PCR和Western Blotting檢測基因敲除情況；

6. 細(xì)胞株傳代培養(yǎng)，并進行PCR二次鑒定。

實驗收費標(biāo)準(zhǔn)和周期

說明：關(guān)于基因敲除細(xì)胞系的篩選原則上進行一次轉(zhuǎn)染和流式篩選，公司確保篩選到單等位基因敲除細(xì)胞系。若未獲得雙等位基因敲除細(xì)胞系則再進行一次轉(zhuǎn)染和篩選。如果仍未獲得等位基因敲除細(xì)胞系則終止實驗，公司提供單等位基因敲除細(xì)胞系。

客戶須知

1. 請?zhí)峁┐贸募?xì)胞系和培養(yǎng)條件；

2. 請?zhí)峁┐贸蛐畔ⅲɑ蛎Q，物種，NCBI號等）；

3. 如有特殊要求（特定位點敲除等）請?zhí)崆罢f明；

公司交付產(chǎn)物

1. 基因敲除細(xì)胞系兩管，每管細(xì)胞數(shù)目>1*106；

2. 敲除細(xì)胞系基因型鑒定結(jié)果；

3. 敲除細(xì)胞系熒光定量PCR和WB鑒定結(jié)果；

4. 實驗報告。

基因擴增，載體構(gòu)建和蛋白表達(dá)純化

實驗原理

利用基因工程的基本原理和方法，將DNA或cDNA片段與載體連接，獲得能夠表達(dá)目的基因的載體。我們可以在目的基因上添加小分子量標(biāo)簽（FLAG，HA，myc等）方便后續(xù)表達(dá)檢測。也能夠加入熒光標(biāo)簽（GFP, RFP, CFP,BFP, YFP等）直觀的觀察蛋白表達(dá)情況。我們獨特的多順反子表達(dá)載體，可以同時表達(dá)多個蛋白，為研究蛋白相互作用或者多亞基蛋白共表達(dá)提供了極大的便利。根據(jù)客戶的需要，我們還可以對載體進行改造，滿足不同的實驗?zāi)康暮鸵?。在進行基因功能學(xué)實驗時，通常要對基因的某些位點進行突變。我們通常使用高保真Pfu酶，利用重疊延伸PCR或者定點突變試劑盒的方法在目的基因中引入單個或多個堿基的突變，包括堿基的添加，刪除，替換等，從而對改變的目的蛋白進行性狀和表型的研究。對于未知基因的序列，Rapid-amplification of cDNA ends（RACE）方法可以滿足大家的要求。這是一種基于一段已知的cDNA片段，通過向兩端延伸擴增從而獲得完整的3'端和5'端的方法。本公司有多年RACE擴增經(jīng)驗和優(yōu)化后的實驗技術(shù)，能夠有效擴增大片段的未知序列。

服務(wù)內(nèi)容

1．通過對序列進行分析，設(shè)計特異性引物擴增目的片段；

2．通過酶切連接或In-Fusion等方法，將目的片段克隆至表達(dá)載體上；

3．原核表達(dá)蛋白可通過IPTG等進行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測，Western Blotting檢測；

4．將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，直接熒光觀察或Western Blotting檢測，驗證蛋白表達(dá)；

5．原核表達(dá)蛋白的大量表達(dá)和純化；

6．真核表達(dá)蛋白體內(nèi)和體外功能研究（詳見細(xì)胞功能學(xué)實驗部分）；

7. 基因編碼區(qū)，非編碼區(qū)的單位點，大片段基因，高GC含量和重復(fù)序列基因的單位點和多位點突變；

8. 未知基因3’和5’RACE特異性引物的設(shè)計和3’和5’端片段的擴增；

載體構(gòu)建基本流程

載體構(gòu)建收費標(biāo)準(zhǔn)

注：基因組DNA或cDNA＞1ug；質(zhì)粒＞100 ng；PCR產(chǎn)物＞100ug；

蛋白表達(dá)純化基本流程

蛋白表達(dá)和純化收費標(biāo)準(zhǔn)

基因定點突變基本流程

公司交付

1.含質(zhì)粒的甘油菌和質(zhì)粒（>5微克）

2. 測序結(jié)果和堿基序列圖

3 表達(dá)純化的蛋白和電泳圖

4. Western blotting檢測結(jié)果

5. 實驗報告

熒光定量PCR

實驗原理

在進行基因功能研究時，我們通常會通過觀察靶基因的表達(dá)量變化來判斷目的基因或藥物等對細(xì)胞的影響。靶基因的表達(dá)量變化可以通過在mRNA和蛋白水平進行檢測。蛋白水平通常使用Western Blotting方法進行（詳見WB檢測服務(wù)目錄），而在mRNA水平有多種方法進行檢測，比如反轉(zhuǎn)錄PCR，Northern Blotting和熒光定量PCR（RT-qPCR）等。熒光定量PCR方法由于其可以準(zhǔn)確快速的對多個基因進行精確定量而得到廣泛的應(yīng)用。該方法是一種基于普通PCR的改進方法，在PCR擴增的過程中利用具有DNA親和性的熒光染料或熒光標(biāo)記的核苷酸探針，每個循環(huán)收集一次熒光強度信號。通過熒光強度的強弱反應(yīng)擴增片段的豐度。隨著PCR 反應(yīng)中目的片段含量的增加，熒光信號強度也等比例增強。從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。這種方法比普通的反轉(zhuǎn)錄PCR能更加直觀的反應(yīng)產(chǎn)物含量的多少給出定量的結(jié)果，與Northern Blotting相比更加簡潔直觀，目前是在對基因mRNA水平檢測最為常用的一種方法。

服務(wù)內(nèi)容

一、核酸提取

使用試劑盒或者Trizol法對哺乳動物細(xì)胞和組織，植物，酵母，真菌，細(xì)菌和土壤等樣品中的RNA和DNA進行提取。并對提取的樣品進行濃度和純度的檢測，作為后續(xù)檢測用模板。

二、RNA的反轉(zhuǎn)錄

與可以進行直接檢測的DNA樣品不同，RNA樣品需要進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA來進行進一步檢測。我們首先使用進口的DNase對RNA樣品進行處理，消除基因組DNA對后續(xù)檢測的干擾，再使用進口反轉(zhuǎn)錄試劑盒或者反轉(zhuǎn)錄酶對RNA樣品進行高效的反轉(zhuǎn)錄，使得微量表達(dá)的樣品也能進行很好的擴增。

三、熒光定量PCR檢測基因表達(dá)量

根據(jù)檢測目的的不同，熒光定量PCR可以分為相對熒光定量PCR和絕對熒光定量PCR兩種。每種定量方法中根據(jù)檢測標(biāo)志物的不同分為染料法和探針法。較為常用的染料是SYBR Green，其能夠與DNA高度特異性的結(jié)合，具有很高的靈敏度。對于低表達(dá)量的樣品或特殊樣品，我們建議使用探針法進行檢測。根據(jù)目的序列設(shè)計一條寡核苷酸探針，再標(biāo)記上熒光基團，能夠極大的增加檢測靈敏度和特異性?？梢詸z測低至個位數(shù)的目的基因樣品。

四、特殊方法對待特殊樣品

我們擁有十年以上的核酸提取經(jīng)驗，對于特殊樣品，如土壤，我們優(yōu)化了傳統(tǒng)的Trizol方法，能夠高效的提取高純度的核酸樣品，可滿足后續(xù)熒光定量和高通量測序的需求。對于核酸含量很少的樣品，如拭子，環(huán)境水樣等。我們使用特殊的富集方法將樣品濃縮以減少樣品損失，再利用公司獨特的提取方法最大限度的提取樣品中的核酸，能夠滿足后續(xù)的檢測需求。此外，對于其它無可參考方法的樣品，我們可以根據(jù)經(jīng)驗創(chuàng)造屬于它的個性提取方法。

五、我們免費提供

（1）引物和探針的設(shè)計，以及引物的合成；

（2）絕對定量和相對定量選擇的咨詢和建議；

（3）探針法和染料法選擇的咨詢和建議；

（4）核酸定量；

（5）內(nèi)參基因的檢測；

（6）數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析；

（7）其它我們熒光定量PCR相關(guān)的能幫助到您的任何問題；

基本流程

服務(wù)收費參考

客戶須知

1、待檢測樣品最好新鮮收集，如需累計樣品可將樣品放入-80保存以供DNA提取，或加入Trizol后-20保存以供RNA提??；

2、收集好的樣品應(yīng)盡快送至實驗室進行核酸提??；

3、預(yù)實驗開始前需提供待測基因序列或NCBI序列號以供引物設(shè)計和探針設(shè)計，客戶也可直接提供引物和探針序列進行合成。

4、對于多種處理的樣品最好能夠提供陽性和陰性對照樣品；

5、我們可以免費提供人，靈長類，大小鼠的內(nèi)參基因檢測，通常默認(rèn)的內(nèi)參基因為beta-actin，beta-tubulin，gapdh。如果需要檢測其它特殊的內(nèi)參基因請?zhí)崆案嬷?/span>

6、雙方簽訂合同后，收取預(yù)付后進行試驗；

7、如需參考國內(nèi)外文獻(xiàn)進行實驗請?zhí)峁┫嚓P(guān)文獻(xiàn)依據(jù)；

8、血液，體液和糞便樣品需保證不含有傳染性病原體，如有特殊需求請?zhí)崆案嬷缥刺崆案嬷斐扇藛T危害的需追究法律責(zé)任；

公司提供

1、預(yù)實驗和正式實驗結(jié)果（包括Ct值，拷貝數(shù)等）；

2、絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和菌株；

3、剩余引物和探針及其序列信息；

4、實驗報告